三酰甘油氧化聚合物的檢測(cè)、評(píng)價(jià)及應(yīng)用

三酰甘油氧化聚合物（Oxidized triacylglycerol polymers，TGP）是油脂氧化過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)極其復(fù)雜的深度氧化產(chǎn)物，在油脂的加工、儲(chǔ)藏、使用過(guò)程中TGP總量持續(xù)遞增，經(jīng)再次常規(guī)精煉也不衰減，是一個(gè)可以客觀(guān)表征油脂氧化程度的內(nèi)源性指標(biāo)。針對(duì)目前油脂氧化指標(biāo)存在的缺陷和高靈敏度TGP測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)缺失等問(wèn)題，開(kāi)展了TGP與油脂氧化關(guān)聯(lián)性及其在油脂質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的相關(guān)研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：

1、TGP的制備型快速柱層析-高效體積排阻色譜檢測(cè)方法研究。采用制備型快速柱層析-高效體積排阻色譜（PFC-HPSEC）技術(shù)，研究建立了一種適于檢測(cè)冷榨油和精煉食用植物油等低含量TGP（小于3%）油脂的檢測(cè)方法，用中壓Flash柱預(yù)分離油脂極性組分，經(jīng)高效體積排阻色譜細(xì)分TGO、TGD、ox-TG、DG、FFA等組分，用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量定性，根據(jù)重量法測(cè)定油脂極性組分含量及高效體積排阻色譜面積歸一法定量油脂中TGO和氧化三酰甘油二聚物（TGD）百分含量，結(jié)果表明：TGO和TGD2分別在28-1800mg/L、11-2800mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）均高于0.99，TGO及TGD的低檢測(cè)限分別為28mg/L、11mg/L，定量下限分別為113mg/L、44mg/L；相當(dāng)于油脂中TGP的低檢測(cè)限為0.01%(100μg/g)。制備型快速柱層析的3個(gè)極性組分加標(biāo)水平的平均回收率為95%-98%。制備型快速柱層析-高效體積排阻色譜檢測(cè)油脂TGP的重復(fù)性RSD均小于10%。制備型快速柱層析-高效體積排阻色譜方法與經(jīng)典的硅膠柱-高效體積排阻色譜方法在定量油脂TGP的相對(duì)誤差低于8.9%。

2、TGP與油脂氧化程度關(guān)聯(lián)性研究。采用高效體積排阻色譜（HPSEC）技術(shù)，對(duì)食用植物油室溫儲(chǔ)藏氧化、Schaal烘箱法加速氧化、高溫煎炸氧化等三種油脂氧化過(guò)程中產(chǎn)生的極性組分（PCs）及其細(xì)分組分進(jìn)行了比較分析，同時(shí)監(jiān)測(cè)了油脂氧化過(guò)程中內(nèi)源性天然抗氧化劑VE的含量變化，建立TGP與油脂氧化程度關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明：氧化三酰甘油（ox-TG）的量與誘導(dǎo)期呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。氧化三酰甘油寡聚物（TGO）的出現(xiàn)及內(nèi)源性天然抗氧化劑VE的耗盡標(biāo)志誘導(dǎo)期結(jié)束的。TGO基本都是氧化三酰甘油的三聚體，推測(cè)主要是含環(huán)氧基、酮基、醛基、C-C鍵橋、C-O-C鍵橋的甘油酯。ln(TGO/TGO0)與大豆油氧化程度成線(xiàn)性關(guān)系。

3、TGP的凝膠滲透色譜色譜制備與穩(wěn)定性研究。采用制備型快速柱層析聯(lián)用高壓凝膠滲透色譜技術(shù)，從油脂極性組分制備mg量級(jí)TGO和TGD，考察了TGP的二聚體和寡聚體在多種物理狀態(tài)與儲(chǔ)藏條件下的穩(wěn)定性，用高效體積排阻色譜測(cè)定了極性組分各相關(guān)組分的分子量，結(jié)果表明：高壓凝膠滲透色譜制備TGP的優(yōu)化條件為：采用三級(jí)串聯(lián)凝膠滲透色譜柱規(guī)格Waters UltrastyragelTMLinear四氫呋喃柱（19mm×300mm）+Waters UltrastyragelTM500四氫呋喃柱（19mm×300mm）+Waters UltrastyragelTM100四氫呋喃柱（19mm×300mm），上樣量500ul，流動(dòng)相四氫呋喃，流速4.2mL/min，TGO、TGD的收集時(shí)間分別為29.00-32.10min、32.25-33.50min。以油脂極性組分為原料的高壓凝膠滲透色譜制備TGP周期約為1h，單次分別獲得0.49mgTGD與0.23mgTGO，純度均在99%以上，TGD與TGO得率分別為29%和13%。TGD與TGO的凝膠滲透色譜制品適宜在四氫呋喃溶液穩(wěn)定儲(chǔ)藏，-20℃至20℃各溫度條件下60d大衰減均低于3%，TGP固體即使-20℃保存60d也衰減10%，在25℃室溫下使用不應(yīng)超過(guò)6h。極性組分中TGO、TGD、ox-TG、DG的分子量（Mw）分別為2469、1728、908、510，TGO以三聚體為主。

4、TGP的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。研究了不同TGP濃度對(duì)巨噬細(xì)胞Ana-1的作用，采用倒置相差鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，激光共聚焦鏡觀(guān)測(cè)細(xì)胞凋亡，酶標(biāo)定量胞外乳酸脫氫酶，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)活性氧（ROS），結(jié)果表明：50μg/mL濃度的TGP致細(xì)胞明顯損傷，該濃度下的巨噬細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下存活率明顯下降、增殖能力受到顯著抑制、吞噬中性紅的能力顯著降低、乳酸脫氫酶釋放量顯著上升，細(xì)胞早期凋亡明顯?；钚匝踹^(guò)度產(chǎn)生是TGP致細(xì)胞損傷的主要原因之一。TGD與TGO細(xì)胞毒性差異不明顯，支持Billek的油脂TGP低吸收率的結(jié)論，尚不能確定與惡性腫瘤相關(guān)性。

5、基于TGP的油脂質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)用。開(kāi)展了基于TGP的地溝油檢測(cè)、冷榨油鑒別和煎炸油質(zhì)量控制、毛油質(zhì)量評(píng)價(jià)等應(yīng)用研究。比較分析食用植物油與地溝油兩大樣本庫(kù)的TGP，結(jié)論如下：12種常見(jiàn)食用植物油41個(gè)樣本TGP含量0.69±0.41，3類(lèi)典型地溝油64個(gè)樣本TGP含量6.01±3.44，差異極其顯著，據(jù)此可以一定程度準(zhǔn)確鑒別地溝油；冷榨油具低TGP特征可顯著區(qū)別于精煉油；煎炸油中TGP與PCs線(xiàn)性相關(guān)，TGP直接指示煎炸油質(zhì)量；毛油的TGP反映其新鮮程度。TGP在油脂質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，依賴(lài)于分類(lèi)油脂的TGP基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)。